LABORATOIRE D'IMMUNOLOGIE 

ET MEDECINE INTERNE

Les auto-anticorps

L'apport essentiel du laboratoire d'immunologie en médecine interne consiste à détecter les nombreux auto-anticorps qui peuvent être présents au cours des maladies systémiques : auto-anticorps anti-nucléaires, auto-anticorps anti-cytoplasmiques et anti-tissus non spécifiques d'organes, anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires (ANCA), anticorps anti-phospholipides et facteurs rhumatoïdes.

En liaison avec le laboratoire de biochimie, il peut également être amené à étudier d'autres paramètres tels que les cryoglobulines, les complexes immuns circulants et le complément sérique.

Stratégie et méthodes de détection des auto-anticorps

Les auto-anticorps dirigés contre les structures cellulaires servent de marqueurs immunologiques dans le diagnostic et parfois le pronostic de certaines maladies auto-immunes mais sont d'inégale spécificité : étant donné la diversité des situations auxquelles ils peuvent correspondre (connectivites mais aussi cancers, insuffisance rénale, mononucléose infectieuse…) ils n'ont pour la plupart pas de valeur diagnostique s'ils ne sont pas confrontés à la clinique : ils peuvent même apparaître chez le sujet normal, bien qu'à taux faible, au cours d'une grossesse ou du vieillissement.

Ils comprennent les anticorps antinucléaires (ANA pour "antinuclear antibodies") mais aussi des anticorps anti-cytoplasmiques.

(cliquer ci-après pour consulter les Schémas de rappel des principales structures cellulaires)

Leur détection et leur caractérisation sont une étape déterminante devant toute manifestation clinique évoquant une maladie systémique mais ils sont trop nombreux pour qu'il soit possible d'explorer en routine tous les systèmes d'anticorps et d'antigènes nucléaires connus. Il faut donc concevoir une stratégie et une hiérarchie des examens de dépistage et d'identification à pratiquer. La stratégie habituellement retenue est celle des examens en cascade. L'immunofluorescence indirecte en constitue la première étape. Si un anticorps est dépisté, il est titré et son aspect en fluorescence décrit.

L'immunofluorescence indirecte sur cellules Hep-2

L'immunofluorescence indirecte est la méthode de choix pour la recherche des anticorps antinucléaires car c'est une méthode simple, rapide et adaptée aux examens en série. Ses performances ont été nettement améliorées par l'introduction il y a quelques années des cultures cellulaires en remplacement des coupes

On décrit classiquement les aspects homogène, homogène à renforcement périphérique, moucheté et nucléolaire.

HOMOGENE

MOUCHETE

NUCLEOLAIRE

NUCLEAIRE ET

CYTOPLASMIQUE

IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

 

L'aspect de la fluorescence est fortement évocateur pour certains anticorps (par exemple les anti-centromères ou les anti-PCNA) mais, le plus souvent, ne permet pas à lui seul de déterminer la spécificité des anticorps, qui devront être identifiés grâce à d'autres méthodes (ELISA, RIA, immunoblot...).

Aspects des anticorps antinucléaires

détectés par immunofluorescence sur cellules HEp-2

TYPE et ASPECT

ANTICORPS

Homogène

Anti-ADN natif, dénaturé, anti-histones, etc.

Homogène à renforcement

périphérique

Anti-lamines A, B, C et

autres composants de la membrane nucléaire

Moucheté

Anti-antigènes nucléaires solubles (= anti-ENA)

  • Anti-ribonucléoprotéines (= anti-RNP)
  • Anti-Ssa (Ro) ou SSb (La)
  • Anti-Scl-70
  • Anti-Sm
  • Anti-PCNA

Anti-centromères (plaques équatoriales)

Autres...

Nucléolaire

Anti-PmScl

Anti-Polymérase I

Anti-U3 snRNP

Autres...

 

Les anticorps anti-ADN natif (ADNn)

Dans un contexte de lupus érythémateux disséminé (LED), l'examen prioritaire est la recherche d'anticorps anti-ADN natif (ADNn) ou double brin. Les  méthodes les plus utilisées  sont :

Crithidia luciliae est un parasite hémoflagellé non pathogène pour l'homme. Les anticorps anti-ADNn donnent une fluorescence intense de l'ADN circulaire de la mitochondrie géante située dans la partie caudale du parasite, et quelquefois du noyau. Une fluorescence isolée du noyau est sans valeur. L'IFCL est un bon test qui convient pour la routine. Il est moins sensible que le test de Farr mais sa spécificité est comparable.

Le principe de ce test consiste à incuber le sérum du patient avec de l'ADNn radiomarqué puis à précipiter les immunoglobulines avec du sulfate d'ammonium. L'ADNn ne précipite que s'il existe dans le sérum des anticorps anti-ADNn qui coprécipitent celui-ci. Le résultat du test s'exprime en pourcentage d'ADNn précipité (normes : 20-25%) ou en unités internationales. Le principal inconvénient de ce test est de faire appel à de l'ADN radiomarqué.

Ce test se pratique dans des microplaques dont les puits sont recouverts d'ADNn. Après incubation avec le sérum du patient, on recouvre les puits avec des anticorps anti-immunoglobulines humaines couplés avec un enzyme puis, après une nouvelle incubation, on révèle l'activité enzymatique avec le substrat de l'enzyme. On en déduit ensuite le taux d'anticorps du patient puisque la densité optique de la coloration qui se développe alors est proportionnelle à la quantité d'anticorps présente dans le milieu.

Ce test est aussi sensible que le test de Farr mais il est moins spécifique (des anticorps anti-ADNn sont décelés chez des patients n'ayant pas de LED). Le double dépistage des anticorps anti-ADNn par méthode ELISA et par immunofluorescence sur Crithidia luciliae permet d'obtenir des résultats aussi fiables que le test de Farr. Dans les quelques cas où ces deux tests divergent, une confirmation par le test de Farr est nécessaire.

Les anticorps anti-ADN dénaturé

Ils sont présents dans le LED, la polyarthrite rhumatoïde et d'autres connectivites mais leur intérêt pratique se limite essentiellement au diagnostic d'un lupus induit médicamenteux. S'il existe des anticorps antinucléaires de type homogène justifiant cette recherche, on pratiquera selon les cas le test de Farr ou l'ELISA avec de l'ADN dénaturé (ADNd).

 

Les anticorps anti-histones

Ils se rencontrent dans les mêmes circonstances que les anti-ADNd et présentent pratiquement le même intérêt diagnostique. Leur recherche peut se faire par méthode ELISA avec des microplaques recouvertes d'histones ou par immunofluorescence indirecte sur coupes traitées avec de l'acide chlorhydrique qui élue les histones (s'il y a extinction de la fluorescence des noyaux, on en déduit donc que les anticorps décelés sont des anti-histones).

 

Les anticorps anti-antigènes nucléaires solubles (ENA) et nucléolaires

Le terme d'antigènes nucléaires solubles (ou ENA pour "extractible nuclear antigens") a été initialement utilisé pour désigner les protéines et nucléoprotéines nucléaires solubles en tampon phosphate. Les extraits nucléaires habituellement utilisés pour dépister les auto-anticorps sont contaminés par la chromatine, les ribosomes et certaines protéines cytoplasmiques. Par abus de langage ces contaminants sont souvent inclus parmi les antigènes nucléaires solubles. Les antigènes nucléaires solubles sont extraits à partir du thymus de veau ou de lapin sauf l'antigène SS-A (ou Ro) pour lequel on utilise la rate humaine.

Les techniques habituellement utilisées pour dépister les anti-ENA sont l'immunodiffusion double d'Ouchterlony et les techniques immunoenzymatiques (ELISA et immunoblot).

Dans la méthode d'Ouchterlony, on compare le sérum du patient avec un sérum de référence de spécificité connue. Si les arcs de précipitation sont en continuité, on conclut qu'il y a identité antigénique et que les deux sérums reconnaissent le méme antigène, s'il y a des éperons c'est une non-identité et le sérum du malade est dirigé vis-à-vis d'un antigène différent du sérum de référence.

Immunodiffusion d'Ouchterlony

Immunoélectrophorèse

   

Western Blot (Immunoblot)

Les techniques ELISA et d'immunoblot sont basées sur le même principe mais le support diffère : l'ELISA se pratique dans les puits d'une plaque de polystyrène et l'immunoblot sur des membranes de nylon (voir plus haut le principe des réactions ELISA appliquées à la détection des anti-ADNn).

La technique la plus sensible est la technique ELISA, la moins sensible la méthode d'Ouchterlony.

Découvert pour la première fois chez un malade dénommé Smith, cet anticorps est très spécifique du LED (20 à 30% des malades). L'antigène Sm est composé de polypeptides présents dans les "small nuclear ribonucleoproteins" (snRNP) contenant des petits ARN riches en uridine (U snRNP) qui participent à l'épissage de l' ARN messager.

L'antigène est une ribonucléoprotéine nucléaire, comprenant des polypeptides situés sur le U1 snRNP. Les anticorps anti-RNP sont présents dans le LED, le syndrome de Sharp ou connectivite mixte, dans les syndromes de chevauchement, la polymyosite.

L'antigène SS-A (ou Ro) fait partie des RNP qui interviennent dans la régulation de la traduction de l'ARN messager.

L'anticorps anti-SS-A est l'anti-ENA le plus fréquemment détecté. Il est présent dans le LED, le lupus cutané subaigu, le syndrome de Gougerot-Sjögren primitif ou associé à une autre connectivite. Il est fréquemment détecté chez les mères d'enfants ayant un bloc auriculoventriculaire congénital, même lorsque la mère ne présente pas des signes cliniques de connectivite.

L'antigène est une protéine qui intervient dans Ia maturation des ARN transcrits par l'ARN polymérase III, c'est-à-dire l'ARN ribosomal 5S, les ARN de transfert, et les Y-ARN. Moins fréquent que l'anticorps anti-SS-A, l'anti-SS-B se rencontre dans les mêmes circonstances pathologiques que celui-ci mais semble cependant un peu plus spécifique du syndrome de Gougerot-Sjögren primitif. Il peut s'observer aussi chez des malades sans syndrome sec mais ayant les autres symptomes du Gougerot-Sjögren.

Ainsi nommé parce que dans les travaux initiaux l'antigène semblait être un polypeptide d'un poids moléculaire de 70 Kd, il a été depuis décrit comme étant la topoisomèrase I, l'enzyme qui relaxe la forme condensée de l'ADN en interrompant provisoirement la continuité d'un des deux brins. L'anticorps anti-Scl-70 est spécifique de la sclérodermie systémique proximale (80% des malades).

L'antigène est la protéine auxiliaire d'une ADN polymérase. En immunofluorescence indirecte, on observe un petit pourcentage de cellules fluorescentes dont le nombre est fonction de l'index mitotigue des cellules, d'où le nom donné initialement à cet antigène de "proliferating cell nuclear antigen" (PCNA).

Cet anticorps est rare : il est présent chez seulement 3% des LED.

A l'exception de PM-Scl désignant l'anticorps associé à la polymyosite et/ou la sclérodermie, les noms des autres sont les initiales du malade chez lequel l'anticorps a été décrit pour la première fois. Ces anticorps sont dirigés contre des antigènes qui ne sont pas tous à proprement parler nucléaires : l'antigène Jo-1 est l'histidyl-transférase, enzyme permettant de fixer l'histidine sur l'ARN de transfert et l'antigène PM-Scl se situe dans le nucléole.

Ces anticorps sont présents dans le sérum des malades atteints de polymyosites, de dermatomyosites ou de syndromes de chevauchement. leur L'intérêt diagnostique est limité car seul un faible pourcentage de ces malades possèdent ces anticorps,.

Principaux autoanticorps anti-antigènes nucléaires solubles

ANTICORPS

ANTIGENES

MALADIES ASSOCIEES

anti-RNP

U1 snRNP

Connectivite mixte

LED

Sclérodermie

anti-Sm

U(l-6) snRNP

LED

anti-SS-A (Ro)

Ro et ARN YC1-5)

Gougerot-Sjögren

LED

anti-SS-B (La)

La, ARN produits par l'ARN polymérase III

Gougerot-Sjögren

LED

anti-PCNA

Protéine auxiliaire d'une ADN polymérase

LED

anti-Scl-70

Topoisomérase I

Sclérodermie

anti-Jo1

Histidyl-tRNA transférase

Polymyosite

anti-PmScl

Nucléolaire

Polymyosite

Sclérodermie

 

Les anticorps anti-centromères

L'aspect de la fluorescence due à ces anticorps est très évocateur car les plaques équatoriales où se fixent les chromosomes des cellules en mitose apparaissent très nettement. Ces anticorps sont présents dans les sclérodermies de type CREST (associant calcifications sous-cutanées, phénomène de Raynaud, sclérose oesophagienne, sclérose cutanée, télangiectasies).

AUTRES AUTOANTICORPS

Les anticorps anti-cytoplasmiques et anti-tissus non spécifiques d'organes

L'immunofluorescence sur cellules Hep-2 peut révéler, outre la présence d'anticorps anti-nucléaires, la présence d'anticorps anti-cytoplasmiques : un aspect fibrillaire évoque par exemple la présence d'anticorps anti-actine ou anti-cytosquelette et un aspect moucheté la présence d'anticorps anti-mitochondries. Il faudra alors poursuivre les investigations par immunofluorescence sur des coupes d'organes riches en ces organites : on utilise habituellement des coupes avec un triple substrat "foie - rein -estomac". Les anticorps anticorps anti-muscles lisses, retrouvés dans l'hépatite chronique active, sont bien visibles sur la coupe d'estomac et les anticorps anti-mitochondries sur les coupes d'estomac et de rein. Dans ce dernier cas, il faudra poursuivre les investigations en recherchant par ELISA ou immunoblot la présence d'anticorps anti-mitochondries de type M2, retrouvés dans la cirrhose biliaire primitive. D'autres auto-anticorps peuvent également être mis en évidence par cette technique, en particulier les anticorps anti-LKM1, (hépatite auto-immune) détectés dans le cytoplasme des cellules hépatiques.

Les ANCA

Les anticorps anticytoplasme des polynucléaires (ANCA) occupent une place grandissante dans le diagnostic des vascularites systémiques. En immunofluorescence indirecte, ces auto-anticorps pouvent donner deux types de fluorescence correspondant à deux anticorps dingés contre deux cibles antigéniques différentes. Une fluorescence cytoplasmique finement granulaire (c-ANCA) correspond à des anticorps dirigés contre la protéinase III. Ces c-ANCA sont retrouvés dans 80% des formes systémiques de maladie de Wegener et dans près de 70% des périartérites noueuses microscopiques. Une fluorescence périnucléaire (pANCA) correspond à des anticorps dirigés contre la myéloperoxydase, retrouvés dans 27% des périartérites noueuses macroscopiques, 66% des maladies de Churg et Strauss, de vascularite rénale et de cholangites sclérosantes primitives. On peut également retrouver des p-ANCA` dont la spécificité n'est pas définie (non dirigés contre la myéloperoxydase) dans des circonstances telles qu'une maladie de Crohn (20%), une rectocolite hémorragique (50%), une endocardite infectieuse, une aspergillose invasive, une tuberculose, une infection à VIH ou HTLV, une mucoviscidose... La positivité de la recherche d'ANCA en immunofluorescence nécessite donc toujours une confirmation en ELISA ou immunoblot de la présence d'anticorps antimyéloperoxydase ou anti-protéinase III et une interprétation des résultats en fonction du contexte clinique et paraclinique.

Les anticorps antiphospholipides

Ceux-ci ne font pas partie des anticorps antinucléaires, mais leur dépistage complète utilement un bilan d'anticorps antinucléaires chez un sujet ayant un anticorps à activité anticoagulante et/ou des thromboses et/ou des avortements à répétition. Le dépistage de ces anticorps se fait par ELISA.

Les facteurs rhumatoïdes (FR)

Il s'agit d'anticorps dirigés contre le fragment Fc des IgG. Le plus souvent, ces anticorps sont de type IgM, beaucoup plus rarement IgG ou IgA. Les tests classiques de mise en évidence de ces anticorps (réaction de Waaler-Rose et réaction au latex) ne permettent de détecter que les anticorps de type IgM.

II s'agit du marqueur biologique essentiel de la polyarthrite rhumatoïde, mais le pourcentage de patients présentant un FR varie avec l'ancienneté de la maladie : 30% au cours des six premiers mois, 80% après quelques années d'évolution. Les FR d'isotype IgG sont retrouvés plus souvent au cours des vascularites rhumatoïdes, et ceux d'isotype IgA au cours des syndromes de Gougerot-Sjögren secondaires à la polyarthrite rhumatoïde. Beaucoup d'autres maladies systémiques peuvent s'accompagner d'une production de FR : le syndrome de Gougerot-Sjögren primaire (30 à 40%), le lupus érythémateux systémique (30%), le syndrome de Sharp (50%), la sclérodermie systémique (30%). Des facteurs rhumatoïdes peuvent également être retrouvés au cours de certaines maladies infectieuses (50% des endocardites bactériennes subaiguës, 100% des leishmanioses), mais aussi au cours des fibroses pulmonaires idiopathiques, des cirrhoses hépatiques et des hémopathies lymphoïdes.

Les cryoglobulines

Les cryoglobulines sont des immunoglobulines qui précipitent au froid et se solubilisent à nouveau lors du réchauffement. Cette définition permet de distinguer les cryoglobulines des autres cryoprotéines, notamment les cryofibrinogènes et les agglutinines froides.

L'analyse immunochimique des cryoglobulinémies permet d'en définir trois types :

Les cryoglobulinémies de type I, composées d'une immunoglobuline monoclonale unique, représentent 25 à 35% de l'ensemble des cryoglobulinémies, et sont associées à une hémopathie maligne lymphoide B.

Les cryoglobulinémies de type II et de type III représentent des cryoglobulinémies mixtes car composées d'immunoglobulines de différents isotypes : des immunoglobulines polyclonales y sont associées (type II) ou non (type III) à un ou plusieurs constituants monoclonaux. C'est dans ces cryoglobulinémies mixtes que l'immunoglobuline, habituellement d'isotype IgM, peut se comporter comme une anti-immunoglobuline avec une activité facteur rhumatoïde anti-IgG. Ces cryoglobulinémies mixtes peuvent ëtre associées aux hémopathies lymphoides B, aux maladies auto immunes et aux maladies infectieuses, en particulier aux infections par le virus de l'hépatite C. Cependant, dans environ 15% des cas, les cryoglobulinémies mixtes n'ont aucune étiologie évidente et sont étiquetées essentielles.

La difficulté de dépistage d'une cryoglobulinémie repose essentiellement sur des problèmes techniques : le prélèvement sanguin doit être maintenu à 37oC jusqu'à sa centrifugation à 37oC et le sérum placé ensuite à 4oC pendant 8 jours avant d'exclure, en l'absence de précipitation, la présence d'une cryoglobulinémie. Le typage de la cryoglobulinémie s'effectue ensuite par immunofixation.

Les complexes immuns circulants

Les techniques de détection sont très nombreuses et les résultats apportés par ces diverses techniques sont discordants. Les recherches en pratique clinique n'ont pas d'intérêt au cours des maladies systémiques bien qu'on puisse détecter des complexes immuns circulants au cours du lupus systémique, des vascularites, des cryoglobulinémies, de la polyarthrite rhumatoïde..., mais aussi au cours de nombreuses maladies infectieuses telles que les endocardites, la lèpre, les hépatites virales ou l'infection parasitaire.

Le complément sérique

L'activité fonctionnelle du système du complément peut être mesurée globalement par dosage de l'activité hémolytique totale (CH 50) ou de façon plus précise sur l'une des deux voies d'activation du complément, voie classique ou voie alterne, par des méthodes immunochimiques qui permettent le dosage pondéral des différentes fractions (C3, C4 surtout).

Les hypocomplémentémies peuvent être secondaires à un défaut le synthèse (déficit congénital, insuffisance hépatocellulaire, dénutrition), à des pertes protidiques (syndrome néphrotique, brûlure étendue), ou à un excès de consommation, observé dans des affections telles que le lupus érythémateux systémique, les cryoglobulinémies mixtes, certaines vascularites, les glomérulonéphrites membranoprolifératives de type II, mais aussi de nombreuses maladies infectieuses, notamment endocardites, hépatites virales, chocs endotoxiniques, septicémies à bacilles Gram négatif...

Les hypercomplémentémies ne sont pas spécifiques et témoignent de l'existence d'un syndrome inflammatoire.

En résumé...

MALADIES AUTO-IMMUNES

DIAGNOSTIC

  • Immunofluorescence sur cellules Hep-2

  • significatif si > 160 (cf gérontologie, grossesse…)

  • Autres techniques (ELISA / RIA, Ouchterlony, électrophorèse et blot)

  • anticorps anti-nucléaires (ADN natif, histones)

  • anticorps anti-antigènes solubles (ENA) : Ssa, SSb, Sm, RNP, Scl-70…

  • anticorps anti-centromères

  •  

    PRONOSTIC

  • anti-RNP sans anti-ADN dans le lupus

  • anti-centromères dans les sclérodermies

  • anti-Jo1 dans les polymyosites (fibrose pulmonaire)

  • anti-SSa sans anti-SSb dans le lupus (atteinte rénale)

  • anti-SSa dans le Gougerot-Sjögren (vascularites)

  • anti-SSa et grossesse (cardiopathie fœtale)

  • SURVEILLANCE

    Le taux de certains anticorps diminue si le traitement est efficace et remonte souvent avant une poussée ou une rechute (exemple : anti-ADN natif dans le LED)

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